El 26 de noviembre de 1504 fallecía en Medina del Campo Isabel la Católica. Hacía meses que circulaban rumores sobre la mala salud de la reina. Pedro Mártir de Anglería, erudito italiano que enseñaba latín y otras disciplinas en la corte, escribía en una carta pocas semanas antes: "Todo su cuerpo está dominado por una calentura que la consume, rehúsa toda clase de alimentos, sufre una sed que la devora y la enfermedad parece que va a terminar en hidropesía".
A los 53 años, la salud de la reina estaba muy quebrantada. A las fatigas que había afrontado desde su juventud se añadían grandes disgustos de índole familiar. En 1497 vio morir a su único hijo varón, el príncipe Juan. Al año siguiente moría la mayor de sus hijas, Isabel, casada con Manuel I de Portugal. El hijo de esta pareja, el príncipe Miguel, que había sido jurado heredero de las coronas de Castilla, Aragón y Portugal, también falleció cuando contaba tan sólo dos años de edad. También desasosegaban a la reina los problemas con su hija Juana, llamada a la sucesión tras la muerte de sus hermanos.
Poco antes de morir, la reina era consciente de que su final se acercaba y decidió otorgar testamento. En él se estipulaba que la heredera de castilla sería su hija Juana, pero el reino lo gobernaría a título de regente su esposo, Fernando el Católico. Isabel no indicaba abiertamente que su hija tuviera problemas de cordura, pero contemplaba la posibilidad de que no estuviera en condiciones de reinar. El párrafo en el que designa como regente a Fernando es revelador:
"Cuando la dicha princesa, mi hija, no estuviere en estos dichos mis reinos, o en algún tiempo haya de ir y estar fuera de ellos, o estando en ellos no quisiere, o no pudiera entender en la gobernación de ellos, que el Rey mi señor rija, administre y gobierne hasta en tanto que el infante don Carlos, mi nieto, hijo primogénito heredero de los dichos príncipe y princesa, sea de edad legítima para regir y gobernar"
Tras la muerte de la reina, pronto surgieron conflictos familiares y tensiones entre el regente y algunos nobles castellanos. Fue un tiempo presidido por la incertidumbre política que culminaría, ya en el reinado de Carlos I, en la conocida como Guerra de las Comunidades, una sublevación de Castilla contra el nuevo monarca.
En cuanto a la guerra de las Comunidades,su presencia en el mundo rural fue destacable como movimiento antiseñorial, la revuelta de las Comunidades tuvo un marcado carácter urbano y municipalista, con claro dominio del patriciado hidalgo y letrado, en ciudades y villas como Toledo, Segovia, Avila, Salamanca, Cuenca, Madrid y Guadalajara. La alta nobleza quedó, en principio, al margen de la revuelta para ponerse del lado del Emperador en cuanto el tono antiseñorial del movimiento provocó las primeras alarmas entre sus miembros.
Su programa aparece, ante todo, en los documentos y manifiestos de la Junta Santa de Avila constituida en septiembre de 1520, y su gran pretensión habría sido conseguir el apoyo efectivo de la reina Juana retirada en Tordesillas y cuya realeza plena reclaman los comuneros frente a los abusos de su hijo. Esta, sin duda, primera gran revuelta del siglo XVI (1520-1521) es una muestra del vigor de la postura particularista castellana frente al universalismo de la idea imperial de Carlos V y sus consejeros, quienes no consiguieron convencer en las Cortes de Santiago-La Coruña de los beneficios que para Castilla tendría la política carolina. Los comuneros defienden los privilegios y libertades del reino frente a la corte y al propio monarca, insistiendo en la necesidad de gobernar Castilla conforme a sus primeros fueros particulares, con el concurso de sus naturales (indigenato) y con el consentimiento de sus cortes privativas.
Sus caudillos más destacados fueron el regidor segoviano Juan Bravo, Francisco Maldonado, de Salamanca, y Juan Padilla, al frente de las milicias municipales de Toledo y quien asumió el mando de las fuerzas comuneras, convirtiéndose en el más importante jefe militar de los sublevados. El 23 de abril de 1521, los comuneros son derrotados por la caballería realista en Villalar; Padilla, Bravo y Maldonado serán ejecutados y sólo la ciudad de Toledo mantendrá viva durante algún tiempo la revuelta. En octubre de 1522, Carlos I concede un Perdón General que pretendía recuperar definitivamente la paz en Castílla tras los "grandes movimientos y alteraciones que en ella ha habido y hubo en ausencia de mí, el Rey... a voz de comunidades".
Su programa aparece, ante todo, en los documentos y manifiestos de la Junta Santa de Avila constituida en septiembre de 1520, y su gran pretensión habría sido conseguir el apoyo efectivo de la reina Juana retirada en Tordesillas y cuya realeza plena reclaman los comuneros frente a los abusos de su hijo. Esta, sin duda, primera gran revuelta del siglo XVI (1520-1521) es una muestra del vigor de la postura particularista castellana frente al universalismo de la idea imperial de Carlos V y sus consejeros, quienes no consiguieron convencer en las Cortes de Santiago-La Coruña de los beneficios que para Castilla tendría la política carolina. Los comuneros defienden los privilegios y libertades del reino frente a la corte y al propio monarca, insistiendo en la necesidad de gobernar Castilla conforme a sus primeros fueros particulares, con el concurso de sus naturales (indigenato) y con el consentimiento de sus cortes privativas.
Sus caudillos más destacados fueron el regidor segoviano Juan Bravo, Francisco Maldonado, de Salamanca, y Juan Padilla, al frente de las milicias municipales de Toledo y quien asumió el mando de las fuerzas comuneras, convirtiéndose en el más importante jefe militar de los sublevados. El 23 de abril de 1521, los comuneros son derrotados por la caballería realista en Villalar; Padilla, Bravo y Maldonado serán ejecutados y sólo la ciudad de Toledo mantendrá viva durante algún tiempo la revuelta. En octubre de 1522, Carlos I concede un Perdón General que pretendía recuperar definitivamente la paz en Castílla tras los "grandes movimientos y alteraciones que en ella ha habido y hubo en ausencia de mí, el Rey... a voz de comunidades".
En cumplimiento del testamento de la reina, y al estar Juana ausente por encontrarse en Flandes con su esposo Felipe, Fernando el Católico asumió la regencia de Castilla.
Cuando llegó a Flandes la noticia de la muerte de la reina y se conoció el contenido del testamento, Juana y Felipe no lo aceptaron. Felipe reclamaba su derecho a reinar, aunque sólo podía hacerlo en condición de consorte de Juana. La pareja contaba con el apoyo de una importante parte de la nobleza del reino.
El primer incumplimiento del testamento tuvo lugar poco después. El 24 de noviembre de 1505 se firmaba la Concordia de Salamanca, un acuerdo entre Fernando el Católico y su yerno, según el cual Felipe asumiría el papel de rey junto a su esposa, pero Fernando continuaría como gobernador de Castilla.
Juana y Felipe llegaron a Castilla en la primavera de 1506. Desembarcaron en Coruña, donde fueron recibidos con alegría por sus partidarios. Era el momento que habían estado esperando para desplazar a Fernando. Felipe quería que abandonase el gobierno de Castilla y se retirase a su reino de Aragón. Por otro lado Felipe, que sólo era rey consorte, buscaba inhabilitar a su esposa. Afirmaba que Juana había dado muestras de inestabilidad mental. Los arrebatos pasionales de Juana dejaban paso a accesos de cólera incontrolados que evidenciaban ciertos desequilibrios. Pero la hija de los Reyes Católicos ofrecía pruebas de sensatez y madurez que permitían refutar que estuviera loca. Su esposo no consiguió inhabilitarla y encerrarla, al negarse las Cortes a incapacitarla como reina.
Una vez en Castilla, Juana y Felipe plantaron cara a Fernando convirtiendo en papel mojado la cláusula del testamento de Isabel. A finales de Junio, Fernando y su yerno firmaron la Concordia de Villafáfila, y el 12 de julio Juana y Felipe eran jurados como reyes de Castilla por las Cortes. Por las mismas fechas Fernando cruzaba la frontera de Aragón con Germana de Foix, su nueva esposa.
En el transcurso de un viaje a Nápoles, Fernando recibió la noticia de la muerte de su yerno Felipe. Oficialmente había muerto a consecuencia de unas calenturas sobrevenidas después de beber agua helada, pero corrió el rumor de que fue víctima de un envenenamiento, y de que detrás de su muerte estaba la mano de su suegro. Ante Fernando se abría ahora la perspectiva de asumir de nuevo la regencia de Castilla, que provisionalmente desempeñaba el cardenal Cisneros.
El rey regresó de Nápoles y se encaminó hacia Burgos. Antes de llegar tuvo un encuentro con su hija Juana, que llevaba un año recorriendo la meseta sin separarse del féretro de su esposo. Su pasión y su cólera se habían convertido en "locura de amor". Su padre decidió entonces recluirla en Tordesillas.
Durante su segunda regencia entre 1507 y 1515, Fernando ajustó cuentas con algunos nobles que habían apoyado a su yerno Felipe. Durante esos años el rey logró dominar a la levantisca nobleza castellana. Privó a ésta de parte de su peso político, pero no pudo reducir su poder económico ni su influencia social.
En los últimos años de la regencia se evidenció la senectud del rey, cada vez más decrépito, sobreviniéndole la muerte el 23 de enero de 1516 en Madrigalejo. Asumió de nuevo la regencia el cardenal Cisneros en nombre del príncipe Carlos, que tanto para castellanos como para aragoneses era un desconocido, porque nunca había pisado la península ibérica.
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